食源性致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)試劑盒

-------微生物快檢試劑盒

食源性致病微生物檢測(cè)是國(guó)際通行的食品安全領(lǐng)域中最主要任務(wù)，隨著我國(guó)社會(huì)發(fā)展水平的提高，也日益成為食品安全的主題。沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，單增李斯特氏菌是最常見(jiàn)的必檢致病菌。

食源性致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法整個(gè)檢測(cè)時(shí)間約為19 h（包括過(guò)濾1 min、增菌18 h、DNA 提取15 min、LAMP 擴(kuò)增45 min）。與其他方法相比，LAMP 方法操作更簡(jiǎn)單，不需昂貴儀器，僅水浴鍋就可以完成，且結(jié)果可用肉眼直接觀察，已被成功應(yīng)用于各種食源性致病菌的快速檢測(cè)。

“食源性致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法”系列標(biāo)準(zhǔn)涵蓋最主要的十五種致病菌（SN/T2754.1-15），已于2011年7月在全國(guó)頒布實(shí)施，華峰公司生產(chǎn)的試劑盒于2011年以來(lái)由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證監(jiān)督委員會(huì)主持陸續(xù)逐一認(rèn)證，已廣泛應(yīng)用于肉類，水產(chǎn)，乳類、蔬菜及其加工制品的食品安全檢測(cè)。
ＳＮ／Ｔ２７５４《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（ＬＡＭＰ）檢測(cè)方法》共分為１５個(gè)部分：
———第１部分：金黃色葡萄球菌；
———第２部分：大腸桿菌Ｏ１５７；
———第３部分：志賀氏菌；
———第４部分：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特菌；
———第５部分：副溶血性弧菌；
———第６部分：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；
———第７部分：空腸彎曲菌；
———第８部分：肺炎克雷伯氏菌；
———第９部分：溶血性鏈球菌；
———第１０部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌；
———第１１部分：產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌；
———第１２部分：溶藻弧菌；
———第１３部分：創(chuàng)傷弧菌；
———第１４部分：假結(jié)核耶爾森氏菌；
———第１５部分：阪崎腸桿菌。
以下以金黃色葡萄球菌LAMP試劑盒為例：
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界中無(wú)處不在，因而食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。在美國(guó)由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%，我國(guó)每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。金黃色葡萄球菌食物中毒的食品主要有各類生肉、熟肉制品，乳及乳制品、蛋及蛋制品和部分淀粉類食品。本公司自主研發(fā)的金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)試劑盒能快速特異地檢測(cè)出此類食品中含有的金黃色葡萄球菌。本品在65℃恒溫條件下擴(kuò)增金黃色葡萄球菌核酸保守序列，其檢測(cè)過(guò)程在專利的“分格式PCR管”中進(jìn)行，在封閉的反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。本品檢測(cè)靈敏度高，能檢測(cè)出各類食品中≤10CFU/25g樣品的金黃色葡萄球菌。

圖1 HF反應(yīng)管示意圖

左圖為HF管分區(qū)示意圖，右圖為陽(yáng)性反應(yīng)管和陰性反應(yīng)管圖。

操作流程:

1. 樣本處理
增菌：按 GB4789.10-2010 對(duì)樣品進(jìn)行增菌。
（1）增菌液DNA的制備：
a) 取標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)的增菌液1mL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，10000r/min離心2min，盡量吸棄上清；
b) 加入80μL DNA提取液，混勻后沸水浴10min，置冰上10min；
c) 10000 r/min離心2min，上清即為核酸模板；取上清置-20℃可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?br /> （2）可疑菌落模板DNA的制備：
對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)方法分離到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入80μL DNA提取液，混勻后沸水浴10min，置冰上10min再按照上述步驟C)制備模板DNA以待檢測(cè)。
2. 核酸擴(kuò)增
a) 取出n支HF反應(yīng)管(n=1管陰性對(duì)照+樣本數(shù)+1管陽(yáng)性對(duì)照)于室溫解凍；
b) 向上述n個(gè)反應(yīng)管內(nèi)按順序分別加入陰性對(duì)照、待檢模板和陽(yáng)性對(duì)照各2.5mL，注意加樣時(shí)槍頭要穿透穩(wěn)定液層加至HF反應(yīng)管大腔內(nèi)（見(jiàn)圖1，工作液腔），蓋緊管蓋并做好標(biāo)記，移至反應(yīng)區(qū)；
c) 置65℃恒溫反應(yīng)60min。
3. 結(jié)果檢測(cè)
反應(yīng)結(jié)束，將HF反應(yīng)管倒置甩動(dòng)2次，再正置甩動(dòng)2次，使工作液與顯色液充分混合，冷卻至室溫后觀察；建議在黑色背景下觀察。

技術(shù)參數(shù)：
1、檢測(cè)范圍：
本品以金黃色葡萄球菌核酸保守序列為檢測(cè)靶標(biāo)，用于食品中金黃色葡萄球菌DNA的定性檢測(cè)，可檢測(cè)金黃色葡萄球菌。
2、靈敏度和特異性：
以6株金黃色葡萄球菌和5株陰性菌株為標(biāo)準(zhǔn)，本品靈敏度為100%，特異性為100%，各項(xiàng)性能指標(biāo)如下：
（1）純菌液靈敏度檢測(cè)低限為10³CFU/mL，人工模擬食品樣品試驗(yàn)檢測(cè)低限為≤10CFU/25g（表略）；
（2）用陰性菌株（10⁷ CFU/mL）進(jìn)行檢測(cè)，符合率為5/5；
（3）用經(jīng)確認(rèn)的金黃色葡萄球菌（10⁷CFU/mL）進(jìn)行檢測(cè)，符合率為6/6。

3、穩(wěn)定性：
本品批間差異小，以分離自食品、經(jīng)確認(rèn)的陽(yáng)性菌株和陰性菌株為標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)三批產(chǎn)品的靈敏度和特異性均為100%。
在-20℃條件下保質(zhì)期為一年。
4、儲(chǔ)存和運(yùn)輸條件：
需在-20℃儲(chǔ)存和運(yùn)輸。盡量避免多次凍融。

產(chǎn)品規(guī)格：
1、包裝規(guī)格：24測(cè)試/盒
2、組成成分：

	規(guī) 格
DNA提取液	1.2mL×2管
HF反應(yīng)管^＊ Sau	共24管
陽(yáng)性對(duì)照DNA Sau	50μL×1管
陰性對(duì)照	50μL×1管

其他致病菌LAMP產(chǎn)品信息：

產(chǎn)品編號(hào)	產(chǎn)品名稱	包裝規(guī)格	備注
FD-01B	沙門氏菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-02B	單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-03B	金黃色葡萄球菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-04B	大腸埃希氏菌O157:H7 LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-05B	副溶血性弧菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-06B	志賀氏菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-09B	空腸彎曲桿菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-10B	小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-11B	創(chuàng)傷弧菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-12B	霍亂弧菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-13B	阪崎腸桿菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	現(xiàn)貨供應(yīng)
FD-14B	溶藻弧菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-15B	肺炎克雷伯氏菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-16B	產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-17B	蠟樣芽胞桿菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-18B	假結(jié)核耶爾森氏菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-19B	溶血性鏈球菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-21B	布魯氏菌LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-22B	霍亂弧菌O1群LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)
FD-23B	霍亂弧菌O139型LAMP核酸檢測(cè)試劑盒	24T	定制生產(chǎn)