桶裝水中銅綠假單胞菌檢測方法的比較

作者：張淑紅，吳清平，徐曉可，張菊梅，潘寶怡、彭飛艇
（廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣東省微生物研究所，廣東廣州 510070）
摘要：分別采用傳統(tǒng)國標(biāo)GB/T 8538-2008 方法、基于OprL 基因的PCR 方法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法檢測桶裝水中的銅綠假單胞菌，比較三種方法的檢測效果。結(jié)果顯示，采集的46 份市場水樣中，用傳統(tǒng)GB8538-2008 方法檢出了3 份陽性樣品，檢出率為6.5%，檢測時(shí)間至少2 天；而PCR 和LAMP 方法都檢出4 份陽性樣品，檢出率為8.7%，并且可在24 h 內(nèi)報(bào)告結(jié)果。PCR 和LAMP 方法與傳統(tǒng)方法相比具有快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)，可用于大批量水樣的快速檢測和結(jié)果初篩。
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種重要的水源性致病菌，廣泛存在于各類型水中，對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病[1~3]。近年來，隨著全球范圍內(nèi)桶裝飲用水消費(fèi)量的不斷上升，國內(nèi)外有關(guān)銅綠假單胞菌污染桶裝水的報(bào)道逐漸增多，引起了諸多學(xué)者和消費(fèi)者的普遍關(guān)注
[4~10]。目前桶裝飲用水銅綠假單胞菌檢測技術(shù)方面，除傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)外，PCR 和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等分子方法逐步建立起來，應(yīng)用于水樣快速檢測中。本文通過對市場銷售的桶裝水進(jìn)行抽樣檢測，比較了傳統(tǒng)培養(yǎng)法與PCR 和LAMP 方法的特點(diǎn)，為桶裝飲用水的快速檢測提供參考。
(全文 略)
本文抽查了廣州市場上46 份各品牌桶裝成品水，平行采用傳統(tǒng)國標(biāo)、PCR 方法和LAMP 方法對銅綠假單胞菌進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)國標(biāo)方法GB8538-2008 檢出3 份陽性樣品（8#、19#和22#），而PCR 和LAMP 方法結(jié)果一致，都可以檢出4 份陽性樣品（2#、8#、19#
和22#）。三種檢測方法對8#、19#和22#樣品的檢測結(jié)果吻合，2#樣品采用傳統(tǒng)的膜過濾和平板培養(yǎng)方法未檢出，但是經(jīng)過PCR 產(chǎn)物測序證明樣品中存在銅綠假單胞菌。造成這種差異結(jié)果的原因主要有兩方面，一方面，分析可能是銅綠假單胞菌處于逆境下的不可培養(yǎng)態(tài)。另一方面，在桶裝水中大量死菌存在時(shí)PCR可以檢測出（PCR 靈敏度約為103 cfu/mL），而傳統(tǒng)方法分離不到，PCR 檢測結(jié)果假陽性。事實(shí)上，按照國家標(biāo)準(zhǔn)要求，我國飲用水處理工廠的水源水和水處理工藝相對嚴(yán)格，銅綠假單胞菌不可能達(dá)到很高的數(shù)量，成品水中存在大量死菌的情況比較少，因此，PCR 檢測結(jié)果是假陽性的可能性較小，基本是由于活菌數(shù)量增長檢測出的結(jié)果。很多情況下，銅綠假單胞菌經(jīng)過水源水消毒，管道消毒和臭氧消毒后，其活力會大大降低，處于非可培養(yǎng)狀態(tài)，導(dǎo)致傳統(tǒng)方法培養(yǎng)不出和檢測結(jié)果的假陰性，另外，在受到水中其他雜菌的抑制時(shí)也可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陰性[16~17]。鑒于此，本文在利用PCR 和LAMP 方法時(shí)進(jìn)行了一定時(shí)間增菌（前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)18 h 是兩種檢測方法最低的增菌時(shí)間），以盡量避免或減少檢測結(jié)果假陰性。綜合比較三種檢測方法可以看出，傳統(tǒng)方法的檢測周期較長，至少2 天報(bào)告結(jié)果，檢測靈敏度低，而PCR 和LAMP 方法都可以在24 h 內(nèi)完成樣品檢測，具有簡便、快速、靈敏等特點(diǎn)。PCR 方法整個(gè)過程約需要22 h（包括過濾1 min、增菌18 h、過濾1 min、DNA 提取15 min、PCR 擴(kuò)增3 h、電泳0.5 h）；LAMP方法整個(gè)檢測時(shí)間約為19 h（包括過濾1 min、增菌18 h、DNA 提取15 min、LAMP 擴(kuò)增45 min）。與其他方法相比，LAMP 方法操作更簡單，不需昂貴儀器，僅水浴鍋就可以完成，且結(jié)果可用肉眼直接觀察，已被成功應(yīng)用于各種食源性致病菌的快速檢測[18~19]。同樣，在水樣檢測方面，為提高檢測效率，可以將PCR和LAMP 應(yīng)用于出廠水樣銅綠假單胞菌的快速初篩。

 國標(biāo)法銅綠假單胞菌檢測儀器試劑：http://marketersbliss.com/anquan/194.html